DNA ligaze

By   /  10. marta 2018.  /  Komentari su isključeni na DNA ligaze

Autor: Goran Tomić

Enzimi koji katalizuju reakciju formiranja fosfodiestarske veze, DNA ligaze (EC 6.5.1.1), otkrivene su 1967. godine od strane laboratorija Gellert-a, Lehman-a, Richardson-a i Hurwitz-a (Lehman 1974). Nakon otkrića diskontinualne replikacije DNA na zaostajućem lancu (Okazaki et al. 1968) postalo je jasno da je jedna od glavnih funkcija ovih enzima u ćeliji spajanje tzv. Okazakijevih fragmenata nastalih tokom replikacije DNA. Takođe, ligaze imaju važnu ulogu u povezivanju prekida u molekulu DNA nastalih tokom ekscizione reparacije (Sancar 1994), oštećenja DNA ili spontanih lezija kao što su abazna mesta ili oksidovane baze (Barnes and Lindahl 2004). Omogućavanjem spajanja susednih krajeva, 3′-hidroksilne grupe i 5′-fosfata, DNA ligaze predstavljaju esencijalne enzime u očuvanju integriteta genoma. Otkriće ovih enzima predstavljalo je kritičnu tačku u razvoju in vitro manipulacije DNA molekulom, tehnika kloniranja, biotehnologije i molekulske dijagnostike. 
Postoje četiri tipa humanih DNA ligaza (I-IV). Ono što je zajedničko za različite humane ligaze jeste konzervirani katalitički domen, dok se ostatak polipeptida razlikuje (Slika 1). DNA ligaze kod sisara poseduju DNA-vezujući domen, nukleotidiltransferazni domen (NT domen) i oligonukleotid/oligosaharid vezujući domen (OB domen) i njihova kompleksnija struktura posledica je postojanja regulatornih regiona koji učestvuju u interakciji sa drugim proteinima, poput PCNA (od engl. proliferating cell nuclear antigen), klizećom klemom i replikacionim faktorom C, tj. punjačem klizeće kleme. Struktura humane DNA ligaze predstavljena je na slici 1.

Big Image

Slika 1. Humana DNA ligaza I (PDB kod 1x9n) u kompleksu sa DNA. Uočava se DNA vezujući domen (DBD, od engl. DNA binding domain). Prisutan je PCNA interagujući domen (PIP). Tri domena, DBD, domen za adenilaciju i OB-domen okružuju DNA, razmotavaju prekinutu DNA i dovode ostatke prekida u kontakt sa domenom za adenilaciju gde se vrši spajanje prekinutog lanca.

 

Mehanizam dejstva

Ligacija DNA predstavlja skup tri sekvencijalne reakcije nukleotidil-transfera (Shuman 2009) što je dato na slici 4. U prvom koraku, nukleofilni napad na α-atom fosfora adenozin trifosfata ili NAD+ od strane ε-NH2 grupe lizina iz aktivnog mesta ligaze dovodi do oslobađanja pirofosfata (PPi), odnosno nikotinamid mononukleotida (NMN) u slučaju bakterijskih ligaza. Ovom reakcijom dolazi do formiranja kovalentnog ligaza-AMP intermedijera gde je adenozin monofosfat vezan P-N vezom za ε-N lizina. U drugom koraku, AMP se prenosi na 5′- kraj prekinutog dela DNA tj. na 5′- fosfatnu grupu u prekinutom delu lanca DNA. Na taj način se gradi DNA-adenilat. U reakciji građenja DNA-adenilata atom kiseonika iz 5′- fosfatne grupe DNA lanca napada atoma fosfora iz ligaza-AMP intermedijera, pri čemu je odlazeća grupa ε-NH2 lizina. U trećem koraku, ligaza katalizuje napad 3′- OH grupe drugog kraja prekinutog lanca na DNA-adenilat, pri čemu s formira fosfodiestarska veza i oslobađa AMP. Na kraju trećeg koraka, prekid u DNA je popravljen. Veoma povoljna ravnoteža ovih hemijskih reakcija u smeru nastajanja proizvoda čini ligaciju DNA praktično ireverzibilnom. Zbog toga, adenilovana forma DNA ligaze je relativno stabilna i verovatno je da su u ćeliji molekuli ligaza već adenilovani i spremni za reakciju sa DNA (Ellenberger and Tomkinson 2008). Takođe, adenilacija ligaze povećava specifičnost enzima u pronalaženju supstrata, tzv. ’’nick-sensing’’ (Sriskanda and Shuman 1998).
DNA ligaze su esencijalni enzimi za očuvanje integriteta genoma jer omogućavaju formiranje fosfodiestarske veze između nukleotida. Ovo svojstvo ligaza učinilo je ove proteine nezamenljivom komponentom molekularno-bioloških tehnika. Ligaze su enzimi koji su omogućili razvoj DNA biotehnologije, omogućavanjem dobijanja rekombinantne DNA i proizvodnje rekombinantnih proteina. Dalja istraživanja u pogledu gena koji kodiraju za ligaze, strukture i regulacije aktivnosti ovih enzima omogućiće dizajniranje specifičnih ligaza za različite molekularno-biološke primene.

Reference:

.   Ellenberger T., Tomkinson A. E. 2008. Eukaryotic DNA Ligases: Structural and Functional Insights, Annu. Rev. Biochem.77: 313–338

.   Barnes D. E., Lindahl T. 2004. Repair and genetic consequences of endogenous DNA base damage in mammalian cells. Annu. Rev. Genet.38: 445- 476

.   Lehman I. R. 1974. DNA ligase: structure, mechanism, and function. Science186: 790-797

.   Okazaki R., Okazaki T., Sakabe K., Sugimoto K., Sugino A. 1968. Mechanisms of DNA chain growth. I. Possible discontinuity and unusual secondary structure of newly synthesized chains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA59: 598–605

.   Sancar A. 1994. Mechanisms of DNA excision repair. Science266: 1954–1956

.   Shuman S. 2009. DNA ligases: Progress and Prospects. The Journal of Biological Chemistry284 (26): 17365-17369

.   Sriskanda V., Shuman S. 1998. Chlorella virus DNA ligase: nick recognition and mutational analysis. Nucleic Acids Research26: 525–531

  

RSS
%d bloggers like this: